RNA提取 RT-PCR技术专题

RNA提取技术

“从RNA提取到荧光定量 从 提取到荧光定量PCR”解决方案 提取到荧光定量 解决方案 ―核酸纯化系统TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD

市场部

蒋彦波

2008年4月 武汉 2008年

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RNA相关知识及提取原理 相关知识及提取原理 RNA提取流程 提取流程 特殊组织RNA的提取 的提取 特殊组织 RNA的评价、鉴定与保护 的评价、 的评价 TIANGEN公司 公司RNA提取产品选择指南 公司 提取产品选择指南

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细胞中RNA的种类和含量 的种类和含量 细胞中不同丰度 高丰度 组织名称 肝脏 脾脏 心脏 大脑 中丰度 胚胎 肾脏 肺 膀胱 低丰度 骨 脂肪 高丰度 中丰度 低丰度 成纤细胞 人白细胞 酵母 拟南芥叶片 烟草叶片 玉米叶片 样品量 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 105 105 105 1mg 1mg 1mg 0.50.5-1μg 0.50.5-1.5μg 0.20.2-0.5μg 0.050.05-0.1μg 0-0.05μg 0.050.05-2μg 2-4μg AAAAAA 总RNA含量 RNA含量

RNase

rRNA

tRNA

AAAAAA mRNA

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RNA提取的基本方法 提取的基本方法——裂解原理不同 提取的基本方法 裂解原理不同异硫氰酸胍/苯酚法 异硫氰酸胍 苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋 白体上的蛋白变性， 白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 DNA和 由于在特定pH 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离 分别位于整个体系中的中间相和水相，

胍盐/β-巯基乙醇法 胍盐 巯基乙醇法盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性 盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性 RNase β-巯基乙醇变性蛋白

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RNA提取的基本方法 提取的基本方法——吸附方法不同 提取的基本方法 吸附方法不同沉淀法 介质吸附吸附材料 硅基质 阴离子交换树脂 磁珠 纯化原理 高盐低pH值结合核酸 高盐低pH值结合核酸 pH 低盐高pH pH值洗脱 低盐高pH值洗脱 低盐高pH值结合核酸 低盐高pH值结合核酸 pH 高盐低pH pH值洗脱 高盐低pH值洗脱 磁性微粒挂上不同基团可 吸附并携带RNA 吸附并携带RNA

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RNA相关知识及提取方法原理 相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 提取流程 特殊组织RNA的提取 的提取 特殊组织 RNA的评价、鉴定与保护 的评价、 的评价 TIANGEN公司 公司RNA提取产品选择指南 公司 提取产品选择指南

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样品前处理——实验材料的选择 样品前处理——实验材料的选择 ——

选择新鲜血液，不得超过4 选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜、生长旺盛的组织 选择新鲜、

选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞

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样品前处理——实验材料的保存 样品前处理——实验材料的保存 ——可将新鲜血液先进行红

细胞裂解，得到白细胞， 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到白细胞， 然后加入一定量的TRNzol TRNzol, 70℃保存较长时间 然后加入一定量的TRNzol,-70℃保存较长时间

推荐使用专门的RNA样品 推荐使用专门的RNA样品 专门的RNA 储存液进行储存 储存液进行储存

液氮保存， 液氮保存，避免反复冻融 去掉培养基，加入一定量TRNzol 去掉培养基，加入一定量TRNzol ℃保存较长时间 -70 ℃保存较长时间

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样品前处理——处理方式 样品前处理——处理方式 ——液氮研磨 匀浆或液氮研磨 应用红细胞裂解液处理 直接裂解或胰蛋白酶处理

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样品前处理——常见问答 样品前处理——常见问答 ——

Q-1:样品量是否越多越好？最大量 样品量是否越多越好？ RNA RNA

预期得率 A-1:不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会 不是。在试剂盒规定内增加， 得 影响RNA得率 影响RNA得率； 率 得率； 如增加样品起始量， 如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比 例增加。 例增加。 实 得率

处理样品量

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样品前处理——常见问答 样品前处理——常见问答 ——

Q-2:如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？ 如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解 不被降解？ A-2:研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染； 研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染 酶污染； 匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在 匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触， 匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中， 匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保 RNA不被降解。 RNA不被降解。 不被降解

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细胞裂解--释放RNA 细胞裂解--释放RNA --释放异硫氰酸胍/酚 异硫氰酸胍 酚-TRNzol、TRNzol-A+总RNA提取试剂 、 - + 提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇 RNAprep pure系列RNA提取试剂盒 pure系列 系列RNA提取试剂盒 胍盐 巯基乙醇— 巯基乙醇 独特配方-植物RNA提取试剂 独特配方 RNAplant植物 植物 提取试剂

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RNA纯化与获得-- 纯化要求 纯化与获得-- 纯化与获得RNA纯化要求

纯化后不应存在对酶(如逆转录酶) 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 蛋白质、 2 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降 …… 此处隐藏：858字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……