抗 CD20 嵌合抗体的表达与活性检测(4)

-）.557，.7（

师明磊等：抗(=.5

嵌合抗体的表达与活性检测

)-

，荧光显微!使凋亡细胞绿染；"#使死亡细胞红染）

$$］

镜下观测染色情况［。

!结

!"#

果

抗体基因片段的克隆及表达载体的构建

经过%&’"(%、重叠延伸"(%等一系列基因克隆与扩增，测序并修改错误碱基，最终得到完全正确的基因片段，见图)。测序结果证明，所调取抗体恒定区重链为#*+$型，轻链为!

型。

图>（5）,CDE’挑选阳性克隆结果图$各%&’电泳条带

()*+$

,-./0123421.0)/567892:%&’

$：,-./01；.：!23(2$-)401；)：!24.501；4：(266)01；

7：(,).401；8：!,)/401

!"!转染;<=细胞及筛选阳性克隆

直接竞争9,#:;挑选阳性克隆，共筛选-.孔单克隆，其中有.5余株有表达，$<)、$<4、$=)、.;.、.=4、);.、4>$5等-株表达水平较高。细胞单克隆形态见图4（?）。因各单克隆生长速度不同，因此只能分批进行筛选。图4（0）是第一批9,#:;筛选阳性克隆照片，阳性克隆率约.7@。选用羊抗人#*+（23,）作为二抗，检测无血清培养上清呈阳性结果，说明我们研制的抗体中含有人轻重链恒定区，

是人源化的基因工程抗体。

图>（6）表达670)?;%!@嵌合抗体的细胞克隆()*+>（6）;.--/-27.9.A31.99)27670)?;%!@

670)528B

()*+>（5）F29)0)G./-27.99.-./0.85B,CDE’

!"$

表达蛋白的纯化及初步测定

将)次收获上清约$A7,纯化后，得到蛋白溶

液约.7BC。根据紫外检测法测得蛋白浓度推算该单克隆表达水平约为.B*D,。由于能够与"EFGHIJ;亲和柱结合，因此可以进一步判定该蛋白为抗体类物质。

图7为在非还原和还原条件下的:=:’";+9结

果，非还原条件下蛋白质的分子量约$75K=?，和人体内的#*+$的分子量一致。在还原条件下，有.条电泳带，分子量分别为.)K=?和7$K=?，与设计轻重链分子量吻合。表明我们得到的蛋白质是#*+$

型的完整抗体分子。

图HE%E?F’I,检测蛋白

$：还原型:=:’";+9；.：标准蛋白$，6-A4，88A.，4)，)$，.5，$4A4K=?；)：标准蛋白.，..，$-，$$A8，-8，7)K=?；4：

非还原型:=:’";+9

()*+H

J.9K-02:E%E?F’I,

$：EHLMNHL:=:’";+9；.：O?EK$，6-A4，88A.，4)，)$，.5，$4A4K=?；)：O?EK.，..，$-，$$A8，-8，7)K=?；4：JFJ’EHLMNHL:=:’";+9