应用改进的免疫荧光组织化学染色法对水稻根尖细胞微管结构的观察

生物化学与分子生物学

山东农业科学 2010,4:40~42,55ShandongAgriculturalSciences

应用改进的免疫荧光组织化学染色法

对水稻根尖细胞微管结构的观察

计淑霞

1,2

,盖国琛,戴绍军

21,3

,刘 炜

2*

(1 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院,黑龙江哈尔滨 150025;

2 山东省农业科学院高新技术研究中心/农业部黄淮海作物遗传改良与生物技术重点开放实验室,

山东济南 250100;3 东北林业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150040)

摘 要:植物细胞微管在细胞形态建成中具有重要作用。它体积小,且结构始终处于动态变化之中,因此观察到清晰的微管形态有一定的困难。本实验以水稻根尖为材料,介绍了一种改进的植物细胞微管免疫荧光组织化学染色方法,用此方法可以观察到清晰、完整的植物微管形态,此法对观察其它植物细胞微管结构也具有指导作用。

关键词:植物细胞;微管;水稻根尖;免疫荧光组织化学染色

中图分类号:S511;Q245 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)04-0040-04

AnImprovedImmunofluorescenceStainingMethodforObserving

MicrotubuleCytoskeletoninRootTipofRice

JIShu-xia,GAIGuo-chen,DAIShao-jun,LIUWei

1,2

2

1,3

2*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China;

2.High-TechResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneticImprovementandBiotechnology,Huanghuaihai,MinistryofAgriculture,ThePeoples'RepublicofChina,Jinan250100,China;

3.CollegeofLifeScience,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China)

Abstract Themicrotubule(MT)cytoskeletonplaysanimportantroleinplantcellmorphogenesis.As

thevolumeofMTisverysmal,landitsmorphologyisalwaysindynamicchanges,itisverydifficulttoobserveaclearpatternofmicrotubule.Inthispaper,animprovedimmunofluorescencestainingmethodwasintroducedusingtheroottipofriceasexperimentalmaterials,andtheresultsshowedthataclearlyandfinestructureofmicrotubulecytoskeletoncouldbeobserved.Thismethodwillplayaguidingroleinmicrotubulecytoskeletoninvestigationandobservationofotherplantcells.

Keywords Plantcel;lMicrotubule;Roottipofrice;Immunofluorescencestainingmethod 1963年,Ledbetter、Porter和Slautterback几乎同时分别在植物和动物细胞的超薄切片中发现细胞质中存在一种超微结构,该结构就是细胞骨架之一 微管

[1,2]

管的微管蛋白始终处于动态变化之中,因此观察到清晰而又完整的微管形态成为这一研究领域的难题。本实验以水稻根尖为材料,通过免疫荧光的方法,应用共聚焦显微镜对微管结构进行观察,并在传统的免疫荧光制片方法的基础上对样品酶解和压片等步骤进行了改进,最终观察到形态清

。从微管被发现并被确认后,

它一直是细胞生物学研究的热点。然而,植物细胞微管体积较小,其外径仅3~12mm,且构成微

收稿日期:2010-03-03

基金项目:国家自然科学基金(编号:30870191)资助。

作者简介:计淑霞(1975-),女,在读硕士研究生,生物化学与分子生物学专业;盖国琛,实习学生,山东省实验中学高二31班。*通讯作者:刘 炜,副研究员,从事植物分子生物学研究。E-mai:lwheiliu@163 com

生物化学与分子生物学

第4期 计淑霞等:应用改进的免疫荧光组织化学染色法对水稻根尖细胞微管结构的观察晰、结构比较完整的微管。

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1 材料与方法

1 1 材料

水稻 中花11 (OryzasativaL cv Zhonghua11)在人工气候箱培养,采用水培方法,生长的光暗周期为16h(光照)/8h(黑暗),生长温度为(30 0 5) ,相对湿度为70%。待水稻幼苗长出5d后,取初生根根尖部位进行微管结构观察。1 2 主要试剂

免疫荧光实验中用到的主要试剂为纤维素酶、果胶酶和 -微管蛋白一抗(马抗小鼠,产品货号:T9026)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(产品货号:F0257),均购自Sigma公司(Mis-sour,iUSA)。其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1 3 材料处理及应用共聚焦显微镜对微管结构的观察

1 3 1 取样及固定 用解剖刀切下水稻根尖约5mm,将其放入含有1 5%多聚甲醛的PEMT缓冲液(50mmol/LPIPES、5mmol/LEGTA、5mmol/LMgSO4、0 05%(V/V)TritonX-100,pH7 2)中固定1h,用PEMT缓冲液洗涤3次,每次10min。1 3 2 酶解 传统方法:用含有0 5%(W/V)果胶酶和1 5%(W/V)纤维素酶的PEM缓冲液(50mmol/LPIPES、5mmol/LEGTA、5mmol/LMg-SO4,pH7 2)37 条件下酶解70min;改进后:用含有0 5%(W/V)果胶酶和1%(W/V)纤维素酶的PEM缓冲液37 条件下酶解1h,用PEM缓冲液洗涤3次,每次10min。1 3 3 压片 传统方法:把处理好的材料放到载玻片上,并用镊子弄碎,盖上盖玻片。改进后:将根尖放在涂有1%多聚酪氨酸的盖玻片上,将两张盖玻片交错相叠,夹在滤纸中间,压片,弄好后

要室温干燥5min。

1 3 4 孵育 以含有50mmol/LGly的PBS溶液(16mmol/LNa2HPO4、4mmol/LNaH2PO4、150mmol/LNaC,lpH7 2)处理材料30min。

1 3 5 抗体标记 材料加入到一抗(a-tubulin抗体1 600)中,4 反应过夜,用PBS洗涤3次,每次10min,之后加入二抗(1 200),孵育3h,然后用PBS洗涤3次,每次10min。1 3 6 封片 将处理好的材料置于含有0 1%(W/V)间苯二胺的PBS-甘油(1 1,pH9 0)的防荧光淬灭的载玻片上,以盖玻片压好封片。1 3 7 观察 用激光扫描共聚焦显微镜观察、采集图像。FITC所带的绿色荧光激发波长为488nm,用CarlZeissLSMMETA510激光扫描共聚焦显微镜观察,激发波长范围为505~530nm,以40倍油镜(Plan-APOCHROMAT,NA1 3)采集数据。图像存储 …… 此处隐藏：5243字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……