氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立

河北农业大学

硕士学位论文

氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立

姓名：宋洁

申请学位级别：硕士

专业：预防兽医学

指导教师：孙继国

20060617

摘要

氯霉素是第个人Ｉ．合成的广谱抗牛素，冈其效高价廉，住我国畜牧业巾得到』。。泛应用，对畜禽疾病的控制和治疗起钊了重要的作用。随着氯镖素的广泛应Ｈｊ及研究的深入，发现其有许多毒、剐作用，冈此，必须拧制氯霉系存动物性食品中的残留，保障消费者健康与安全。

本文分两部分，第～部分将氯搿索（ｃＡｐ’Ｃｈｌｏｒａｌｌ、ｐｈｃｎｉｃｏＩ）与牛血清ｆＬｆ蛋白（（ＢｓＡ）、卵清门蛋白（ｏｖＡ）利用优化的晕氮化法、混合酸酐法、碳化二亚胺法进行偶联及鉴定，分别作为免疫抗原及包被抗原，免疫抗原注射免疫新西兰大ＦＩ兔获得多抗血清。第＿部分建立了快速榆测氯霉素的ｎＵ接竞予ＥＬＩｓＡ力法，并通过１爻验，对检测过程巾的各Ｊ＿！；！条件进行优化。

分别应』硝重氮化法、混合酸酐法、碳化＿ｑ雌＆法将ｃＡＰ。Ｊ载体蛋ＩＬＩＢｓＡ偶联制备人工合成抗原，以此作为免疫抗原，刚法合成包被抗原。它们的紫外Ｈ描光谱、ｓＤｓ—ＰＡＧＥ电泳、动物免疫试验均表明偶联成功。免疫２～３月龄新西！．犬门兔，获得多抗ｃＡＰ抗血清，硝闻接ｌ乍竞争ＥＬＩｓＡ法测定抗ｊｍ清效价。数据显示，混合酸酊法在合成氯霉紊人Ｊ二抗原方山ｉ较优于其他两种方法；．本试验用过碘酸钠改良法制备辣根过氰化物酶（ＨＲＰ）标址的午抗兔抗体，用辛酸硫酸铵法、ｓｃｐｈａ（Ｉｅｘ．Ｇ一２５、ＤＥＡＥ离了交换提纯纯化血清１２Ｇ，经计算结合物巾各项指标，表明晦轫、抗仆标记成功，并¨通过ｓＤｓ．ＰＡＧＥ电泳和自接Ⅱ』ｓＡ测定也”Ｊ‘得出酶标抗体枷、记成功。

采用混合酸酐法制得的免接抗原免疫兔了得到的抗血清进玎问接竞争ＥＬＪｓＡ实验，优化ＥＬＩｓＡｊｒ作条件，建、Ｚ了问接竞争ＥＬＩｓＡ检测ｃＡＰ方法。方阵滴定法确定理想ｏｖＡ—Ｈｓ．ＨｓＡ包被抗原的浓度为１．２５¨∥ｍＬ，酶标：抗（羊抗兔ＩｇＧ．ＨＲＰ）■作浓度为ｌ：４００以及多抗（ｓＭ２一ＰｃＡｂ）ｆｆＩｉ清的工怍浓度为１：１２８００。以卜述实验条件为基础，以系列稀释的ｃＡＰ标准溶液作为检测刘缘，绘制标准曲线，得到的线性回归直线方程为ｙ＝】．０６９Ｏ．２６３３ｘ，相关系数Ｒ２＝Ｏ．９８６７，从标准曲线可以得知，此方法可测定的最适范围为ｌＯｎｇ／ｍＬ～２００ｎ∥ｍＬ，最小检测限约为Ｏ００ｌｐ∥ｎ１Ｌ。

夺实验所建立的ＥＩ。ＩｓＡ方法的精确度以批内误差（孔Ｍ差异）和批Ｍ误筹（板Ｊ’ｎＪ差异）表示，结果表明孔间差异和扳问甲均差异分别为４．２４％和９．２０％，这表明方法精确度较好。添加叫收率实验测得氯霉素对鸡肉样本住】ｏ～１００ｎ咖Ｌ范围内的平均同收率为９４．８６％士９．５５％。存可测定浓度范刖内，氯霉素（ｃＡＰ）抗皿清与磺胺二甲基嘧啶（ｓｕ】Ｊｊｍｃｔｌｌａｚｊｎｅ）、恩ｉ若沙星（Ｅｎｒ（圳ｏｘａｃｊｎ）、硫酸链霉素（ｓｔｒ印ｔｏｍｙｃｉｎ）、菏霉素（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、氟哌酸（诺氟沙星Ｎｏ棚ｏｘａｃｉｎ）等ｔｌＪ‘能会因同时使片ｊｉ酊导致共同残留的抗生素药物未艟示免疫交叉反应性，与结构相似物氯霉紊琥珀酸盐的交叉反应率ｃＲ５０为５７２，这表明所建立的方法有较高特异性和选择性，适合氯霉素药物残留样本快速检测。为开发具有自主知识产丰义的氯霉素试剂盒打下了良好的基础。关键词：氯霉素：人工抗原：多克隆抗体；酶标抗体；间接竞争乩ＩＳＡ

ｓｔｕｄｙｏｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｈＩｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌｌｍｍｕｎｏｇｅｎａｎｄＤｅＶｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｌｎｄｉｒｅｃｔ

ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＥｌ－ＩＳＡｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣＡＰ

Ｃａｎｄｉ‘ｌａｔｅ：ＳｏｎｇＪｉｃ

Ｓｐ州ｉａＪｔｙ：Ｐｒｅｖｅｎｆｉｖｅ、，ｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ

Ａｄ啊ｓｏｒ：ＰＴｏｆｃｓｓｏｆＳｕｎＪｉｇｕｏ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ｃｈｌｏｒａｎｌｐｈｅｎｉｃｏｌ（ｃＡＰ）ｉｓ

ｕｓｃｄａｈｉｇｌｌｌｙ—ｅ盯ｃｃｔｉｖｅｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｌｒｕｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｃｌｙｉｎａｎｉｌｎａｌ“ｓｓｕｃｓａｎｄ／ｏｒｉｎｓｔｏｃｋｂｒｅｅｄｉｎ笆．ＢｕｔｉｌｈａｓｂｃｅｎｆｂｕｎｄｔｈａｔＣＡＰｒｅｓｊｄｕｅｓ

ｌｏｈｕｍａｎｂｏｄｙａｎｉｍａ】ｐｒｏｄｕｃｔｓｈａｓｔｏｘｊｃｅｆｆｅｃｔｓ

ａＩｌａｌｙｔｉｃａｌｍｅｌｈｏｄ

ＩｎｔｈｅｆｉｒＳｔ

ｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎＴｈｅｒｅｔｌｏｒｃ，ｊｔｉｓｎｅｃｃｓｓａＷｌｏｗｏｒｋｏｕ｛ａｎｔｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇＣＡＰｒｃｓｉｄｕｅｓ．ｐａ九，口ｏ、，加已艇，九ｆⅢⅡ佑“押ｉ加（ＢｓＡ）ａｎ（ｉｅｇｇｓｃｎｌｍａｌｂｕｌｎｉｎ …… 此处隐藏：15734字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……