细胞中活性氧的荧光探针检测法研究进展

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现代预防医学2010年第37卷第22期ModernPreventiveMedicine，2010，Vol.37，NO.22

文章编号：1003-8507（2010）22-4316-02中图分类号：R122.1文献标识码：A

【实验技术及其应用】

细胞中活性氧的荧光探针检测法研究进展

张鑫

综述，王旗

审校

摘要：荧光探针法是一种灵敏的、可提供细胞内靶分子时空信息的活性氧（ROS）检测法。目前常用的荧光探针有

·-）、DCFH和DHR（检测H2O2）等。ROS的检测结果易受以下因素影响：基于氧化还原反应的荧光探针选HE（检测O2

择性差，且反应需要催化剂（过氧化物酶、细胞色素C）；细胞内pH值、抗氧化剂影响检测结果；荧光探针在光照条件下可发生自氧化。近期研究主要集中在如何改进荧光探针的上述局限性。本文对荧光探针法检测细胞内ROS的研究进展进行简要介绍。

关键词：活性氧；荧光探针；DCFH

PROGRESSINMEASUREMENTOFREACTIVEOXYGENSPECIESINCELLSbyUSINGFLU-ORESCENTPROBESZHANGXin，WANGQi.（DepartmentofToxicology，SchoolofPublicHealth，

PekingUniversity，Beijing100191，China）

Abstract：FluorescentprobesaresensitivetoolsinthemeasurementofReactiveOxygenSpeciesincells，anditcanpro-videtemporalandspatialinformationontargetbiomoleculesincellularsystem.Currently，themostfrequentlyusedprobesin-·-），DCFHandDHR（forH2O2）.However，thefollowingaspectstendtomakethedetectionresultsmorecludesHE（forO2

complex：fluorescentprobesbasedonredoxreactionlackselectivityandrequireacatalyst（PeroxidaseorCytochromeC）forreaction；IntracellularPHandantioxidantscanpotentiallyinfluencethedetectionprocess；also，probeauto-oxidationCouldoccurunderphoto-irritation.SomeimprovementsindetectionofROShavebeenachievedinrecentyears.ThispaperfocusedontheprogressintheROSdetectionusingfluorescentprobes.

Keywords：ReactiveOxidativeSpecies；Fluorescenceprobe；DCFH

活性氧（ReactiveOxidativeSpecies，ROS）是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物，主要由氧化呼吸链中的酶复合体Ⅰ和Ⅲ漏出的

·-电子产生，包括超氧阴离子（O2），羟自由基（HO·），过氧

荧光探针是一类无色、无荧光且稳定存在的染料分子，在与ROS发生反应后，探针的化学结构发生变化，生成具有强荧光的产物，因此通过检测反应产物的荧光强度可在一定程度上反映ROS水平［5］。目前应用最广泛的荧光探针主要有

化氢（H2O2），单线态氧（1O2），次氯酸（HOCl）等。ROS在生物体内参与信号转导、调控基因表达、参与免疫反应，但过量的ROS亦可对生物膜以及蛋白质、脂类、核酸等生物大分子造成氧化损伤。对ROS含量变化的研究有助于揭示各种生命活动的内在分子机制［1，2］。但是由于ROS性质活泼，在体内代谢迅速，而生物体内多种抗氧化物的存在都给ROS的测定带来一定难度。因此，寻找灵敏有效的ROS检测方法已成为研究其生物学作用的关键。细胞中ROS的检测方法主要分为四大类：化学发光法、电子自旋共振法、荧光探针法和分光光度法［3］。其中，荧光探针法凭借高分辨率、高灵敏度、可提供细胞内靶分子时空信息的优点在活性氧的研究中得到广泛应用［4］。本文对该方法的影响因素及检测方法研究进展情况进行简要介绍。

Dichlorofluorescindiacetate（DCFH-DA），双氢罗丹明

（Dihydrorhodamine），Hydroethidine（HE）等。

1.11.1.1

·-用于超氧阴离子（O2）检测的荧光探针

Hydroethidine（dihydroethidium，HE）HE可在细胞内

·-被O2氧化而生成荧光产物Ethidium（E+）（激发波长λEx=520

nm，发射波长λEm=610nm），Ethidium可聚积在细胞内与

·-DNA结合，从而增加荧光强度［6，7］。但有研究发现，HE与O2

反应还可生成另一荧光产物2-hydroxyethidium，其发射波长在

·-的检测［8，9］。另外，在非特异性的567nm，也可用于细胞内O2

过氧化物酶催化作用下HE可与H2O2发生氧化反应，生成一类不同于E+的荧光产物，其发生波长与Ethidium接近，从而对荧光信号产生很大干扰。

1.1.2

1

原理与应用

其他荧光探针1，3-Diphenylisobenzofuran（DPBF）和

2-（2-Pyridil）-benzothiazoline也可用于超氧阴离子的检测，其

·-中DPBF可以检测脂质体中的O2，但检测原理与HE相反，·-·-是通过与O2反应后荧光强度的降低程度反映O2的含量［10，11］。

作者简介：张鑫（1985-），女，预防医学2003级长学制学生，研究

方向：中药毒理学

通讯作者：王旗，E-mail：wangqi@http://

作者单位：北京大学公共卫生学院毒理学系，北京，100191

1.21.2.1

用于过氧化氢（H2O2）检测的荧光探针

Dichlorofluorescindiacetate（DCFH-DA）DCFH-DA

是一种无荧光的脂溶性物质，可以自由穿越细胞膜，在细胞内

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被酯酶水解为水溶性的DCFH，该物质在与ROS发生氧化反应后生成具有强荧光的DCF（λEx=488nm，λEm=525nm）用于检测细胞内的H2O2水平，细胞内的过氧化物酶，细胞色素C或Fe（Ⅱ）

（Fenton反应）可催化该反应的进行。因此早期

应用DCFH检测H2O2的研究需要加入外源的辣根过氧化物酶以催化氧化反应的发生，但后期的研究大多忽略了这一点。另据报道，过高浓度的 …… 此处隐藏：7950字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……