Bulge_LoopTM_miRNA_qRT_PCR_Starter_Kit使用说明

锐博生物专业Bulge_LoopTM_miRNA_qRT_PCR_Starter_Kit使用说明

Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit使用说明

RN：R10039.1

产品简介

Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit配合相应的Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCRPrimer，可特异性检测成熟miRNA序列，采用基于SYBR Green的miRNA qRT-PCR检测方法。

C10210-20

Reagent (In tube)

(20T RT + 100TqPCR)

2.5X Reverse Transcription Mix 2X SYBR Green Mix

160 μl

-20℃

600 μl

Storage

运输保存

产品需低温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，可以稳定保存一年。 使用前请瞬时离心。

实验方法

请参考qPCR反应步骤进行实验，以下步骤仅供参考。 1. miRNA RT反应

1）取5μM RT引物工作液5 μl，加入45μl RNase-free H2O，配置成500 nM RT引物工作液。 2）推荐采用 50μl RT反应体系进行实验，具体参考用量如下表：

Reagent

25 μl体系

50 μl体系

终浓度

RNA Template (2μμμl RT 引物工作液 (500 nM) RNase-free H2O

40 nM 2 μμl 至11 μl

至19 μl

以上体系混匀后，请瞬时离心，70℃放置10min，冰育2min，再加入以下试剂进行RT反应，RT反应程序：42℃ 60 min，70℃ 10 min。

Reagent

2.5X Reverse Transcription Mix RNase-free H2O

25 μl体系

50 μl体系

终浓度 1X

10 μμl 至25 μl

至50 μl

注：1）最佳RT引物浓度需依据预实验摸索，引物浓度范围可在5~200nM之间。

2）RT反应结束后请立即将 cDNA 产物取出，快速置冰上冷却，后续所有步骤均在冰上进行。

2. miRNA qPCR反应

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1）SYBR Green Mix：包括Taq酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR GreenⅠ等。

下表为PCR的反应体系参考：

Reagent

2X SYBR Green Mix RT Product

20 μl体系

50 μl体系

终浓度 1X

10 μμl 2 μμl

200 nM Bulge-LoopTM miRNA Forward Primer (5 μμμl 200 nM Bulge-LoopTM miRNA Reverse Primer (5 μμμl RNase-free H2O

至20 μl

至50 μl

注：1）正反向引物初始反应浓度推荐使用200nM，最佳浓度可以在100nM至500nM之间优化；

2）反向引物与Bulge-Loop序列相匹配，为通用引物。

2）建议使用标准的三步法进行检测，请您在定量PCR仪(以Bio-Rad CFX96为例)上设定如下程序：

循环 1Ｘ

步骤 预变性 变性

40Ｘ

退火 延伸

温度

时间

内容

起始模板变性 95℃PCR模板变性 95℃60℃退火 70℃延伸

注：延伸步骤的反应时间依据具体检测仪器而定，有些仪器（如ABI的PCR仪）无需设置延伸步骤。

3）对于用SYBR GreenⅠ染料法进行的qPCR的检测反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析，检测温度为70℃~95℃，升温速率为0.4℃/次，恒温时间为1 sec/次。